Cum se stabilește viteza unei reacții enzimatice. Dependența vitezei reacțiilor enzimatice de concentrația substraturilor, a enzimelor și a temperaturii. Specificul proceselor cu un singur substrat

§ 12. CINETICA REACŢIILOR ENZIMATIVE

Cinetica reacțiilor enzimatice este știința vitezei reacțiilor enzimatice și a dependenței lor de diverși factori. Viteza unei reacții enzimatice este determinată de cantitatea chimică a substratului reacționat sau a produsului de reacție rezultat pe unitate de timp pe unitate de volum în anumite condiții:

unde v este viteza reacției enzimatice, este modificarea concentrației substratului sau a produsului de reacție, t este timpul.

Viteza unei reacții enzimatice depinde de natura enzimei, care determină activitatea acesteia. Cu cât activitatea enzimei este mai mare, cu atât este mai rapidă viteza de reacție. Activitatea enzimatică este determinată de viteza de reacție catalizată de enzimă. Măsura activității enzimatice este o unitate standard a activității enzimatice. O unitate standard de activitate a enzimei este cantitatea de enzimă care catalizează conversia a 1 µmol de substrat în 1 minut.

În timpul unei reacții enzimatice, enzima (E) interacționează cu substratul (S), ducând la formarea unui complex enzimă-substrat, care apoi se dezintegrează pentru a elibera enzima și produsul (P) al reacției:

Viteza reacției enzimatice depinde de mulți factori: concentrația substratului și a enzimei, temperatura, pH-ul mediului, prezența diferitelor substanțe reglatoare care pot crește sau scădea activitatea enzimelor.

Interesant de știut! Enzimele sunt folosite în medicină pentru a diagnostica diferite boli. În timpul infarctului miocardic, din cauza deteriorării și defalcării mușchiului inimii, conținutul enzimelor aspartat transaminaza și alanin aminotransferaza din sânge crește brusc. Detectarea activității lor face posibilă diagnosticarea acestei boli.

Efectul concentrației de substrat și enzimă asupra vitezei de reacție enzimatică

Să luăm în considerare efectul concentrației substratului asupra vitezei reacției enzimatice (Fig. 30). La concentrații scăzute ale substratului, viteza este direct proporțională cu concentrația sa; apoi, pe măsură ce concentrația crește, viteza de reacție crește mai lent, iar la concentrații foarte mari ale substratului, viteza este practic independentă de concentrația sa și atinge valoarea maximă (V max). La astfel de concentrații de substrat, toate moleculele de enzimă fac parte din complexul enzimă-substrat și se realizează saturarea completă a centrilor activi ai enzimei, motiv pentru care viteza de reacție în acest caz este practic independentă de concentrația substratului.

Orez. 30. Dependenţa vitezei unei reacţii enzimatice de concentraţia substratului

Graficul dependenței activității enzimelor de concentrația substratului este descris de ecuația Michaelis–Menten, care și-a primit numele în onoarea remarcabililor oameni de știință L. Michaelis și M. Menten, care au adus o mare contribuție la studiul cineticii reacții enzimatice,

unde v este viteza reacției enzimatice; [S] – concentrația substratului; K M – constanta lui Michaelis.

Să luăm în considerare semnificația fizică a constantei Michaelis. Cu condiția ca v = ½ V max , obținem K M = [S]. Astfel, constanta Michaelis este egală cu concentrația substratului la care viteza de reacție este jumătate din maxim.

Viteza reacției enzimatice depinde și de concentrația enzimei (Fig. 31). Această dependență este simplă.

Orez. 31. Dependenţa vitezei unei reacţii enzimatice de concentraţia enzimei

Efectul temperaturii asupra vitezei de reacție enzimatică

Dependența vitezei de reacție enzimatică de temperatură este prezentată în Fig. 32.

Orez. 32. Dependenţa vitezei de reacţie enzimatică de temperatură.

La temperaturi scăzute (până la aproximativ 40 - 50 o C), o creștere a temperaturii la fiecare 10 o C în conformitate cu regula lui Van't Hoff este însoțită de o creștere a vitezei de reacție chimică de 2 - 4 ori. La temperaturi ridicate de peste 55 - 60 o C, activitatea enzimei scade brusc din cauza denaturarii sale termice si, drept urmare, se observa o scadere brusca a vitezei reactiei enzimatice. Activitatea enzimatică maximă este de obicei observată în intervalul 40 - 60 o C. Temperatura la care activitatea enzimatică este maximă se numește temperatura optimă. Temperatura optimă pentru enzimele microorganismelor termofile este în zona temperaturilor mai ridicate.

Efectul pH-ului asupra vitezei de reacție enzimatică

Dependența activității enzimatice de pH este prezentată în Fig. 33.

Orez. 33. Influența pH-ului asupra vitezei de reacție enzimatică

Graficul pH-ului este în formă de clopot. Se numește valoarea pH-ului la care activitatea enzimatică este maximă pH optim enzimă. Valorile optime ale pH-ului pentru diferite enzime variază foarte mult.

Natura dependenței reacției enzimatice de pH este determinată de faptul că acest indicator afectează:

a) ionizarea reziduurilor de aminoacizi implicate în cataliză,

b) ionizarea substratului,

c) conformaţia enzimei şi a centrului său activ.

Inhibarea enzimatică

Viteza unei reacții enzimatice poate fi redusă printr-un număr de substanțe chimice numite inhibitori. Unii inhibitori sunt otrăvuri pentru oameni, de exemplu, cianura, alții sunt folosiți ca medicamente.

Inhibitorii pot fi împărțiți în două tipuri principale: ireversibilȘi reversibil. Inhibitorii ireversibili (I) se leagă de enzimă pentru a forma un complex, a cărui disociere cu restabilirea activității enzimatice este imposibilă:

Un exemplu de inhibitor ireversibil este fluorofosfatul de diizopropil (DFP). DPP inhibă enzima acetilcolinesteraza, care joacă un rol important în transmiterea impulsurilor nervoase. Acest inhibitor interacționează cu serina în centrul activ al enzimei, blocând astfel activitatea acesteia din urmă. Ca urmare, capacitatea proceselor celulelor nervoase ale neuronilor de a conduce impulsurile nervoase este afectată. DPP este unul dintre primii agenți nervoși. Pe baza acestuia, au fost create o serie de produse care sunt relativ netoxice pentru oameni și animale. insecticide - substanțe otrăvitoare pentru insecte.

Inhibitorii reversibile, spre deosebire de cei ireversibili, pot fi ușor separați de enzimă în anumite condiții. Activitatea acestuia din urmă este restabilită:

Inhibitorii reversibile includ competitivȘi necompetitiv inhibitori.

Un inhibitor competitiv, fiind un analog structural al substratului, interacționează cu centrul activ al enzimei și astfel blochează accesul substratului la enzimă. În acest caz, inhibitorul nu suferă transformări chimice și se leagă de enzimă în mod reversibil. După disociarea complexului EI, enzima poate intra în contact fie cu substratul și să-l transforme, fie cu un inhibitor (Fig. 34.). Deoarece atât substratul, cât și inhibitorul concurează pentru spațiu la locul activ, această inhibiție se numește competitivă.

Orez. 34. Mecanismul de acţiune al unui inhibitor competitiv.

Inhibitorii competitivi sunt utilizați în medicină. Medicamentele sulfonamide au fost utilizate anterior pe scară largă pentru combaterea bolilor infecțioase. Ele sunt apropiate ca structură de acid para-aminobenzoic(PABA), un factor de creștere esențial pentru multe bacterii patogene. PABA este un precursor al acidului folic, care servește ca cofactor pentru mai multe enzime. Medicamentele sulfonamide acționează ca un inhibitor competitiv al enzimelor pentru sinteza acidului folic din PABA și, prin urmare, inhibă creșterea și reproducerea bacteriilor patogene.

Inhibitorii necompetitivi nu sunt similari structural cu substratul și, atunci când se formează EI, ei interacționează nu cu centrul activ, ci cu un alt situs al enzimei. Interacțiunea inhibitorului cu enzima duce la o modificare a structurii acesteia din urmă. Formarea complexului EI este reversibilă, prin urmare, după descompunerea acestuia, enzima este din nou capabilă să atace substratul (Fig. 35).

Orez. 35. Mecanismul de acțiune al unui inhibitor necompetitiv

Cianură CN - poate acționa ca un inhibitor necompetitiv. Se leagă de ionii metalici care fac parte din grupările protetice și inhibă activitatea acestor enzime. Otrăvirea cu cianură este extrem de periculoasă. Pot fi fatale.

Enzime alosterice

Termenul „alosteric” provine din cuvintele grecești allo - alt, stereo - site. Astfel, enzimele alosterice, împreună cu centrul activ, au un alt centru numit centru alosteric(Fig. 36). Substanțele care pot modifica activitatea enzimelor se leagă de centrul alosteric; aceste substanțe sunt numite efectori alosterici. Efectorii sunt pozitivi - activează enzima, iar negativi - inhibă, de exemplu. reducerea activității enzimelor. Unele enzime alosterice pot fi afectate de doi sau mai mulți efectori.

Orez. 36. Structura unei enzime alosterice.

Reglarea sistemelor multienzimatice

Unele enzime acționează în mod concertat, combinându-se în sisteme multienzimatice în care fiecare enzimă catalizează o etapă specifică a căii metabolice:

Într-un sistem multienzimatic, există o enzimă care determină viteza întregii secvențe de reacții. Această enzimă este de obicei alosterică și este situată la începutul căii metaboliților. Este capabil, prin recepționarea diferitelor semnale, să crească și să scadă viteza reacției catalizate, reglând astfel viteza întregului proces.

Cinetica enzimatică studiază viteza reacțiilor catalizate de enzime în funcție de diferite condiții (concentrație, temperatură, pH etc.) de interacțiune a acestora cu substratul.

Cu toate acestea, enzimele sunt proteine ​​care sunt sensibile la influența diferitelor influențe externe. Prin urmare, atunci când studiază viteza reacțiilor enzimatice, acestea iau în considerare în principal concentrațiile de substanțe care reacţionează și încearcă să minimizeze influența temperaturii, pH-ului mediului, activatorilor, inhibitorilor și alți factori și creează condiții standard. În primul rând, aceasta este valoarea pH-ului mediului care este optimă pentru o anumită enzimă. În al doilea rând, se recomandă menținerea unei temperaturi de 25°C, acolo unde este posibil. În al treilea rând, se obține saturația completă a enzimei cu substratul. Acest punct este deosebit de important deoarece la concentrații scăzute de substrat, nu toate moleculele de enzime participă la reacție (Fig. 6.5, A), ceea ce înseamnă că rezultatul va fi departe de maximul posibil. Cea mai mare putere a reacției catalizate, celelalte lucruri fiind egale, se realizează dacă fiecare moleculă de enzimă participă la transformare, adică. la o concentrație mare a complexului enzimă-substrat (Fig. 6.5, V). Dacă concentrația substratului nu asigură saturarea completă a enzimei (Fig. 6.5, b), atunci viteza reacției nu își atinge valoarea maximă.

Orez. 65.

A - la concentrație scăzută de substrat; 6 - cu concentrație insuficientă de substrat; V - când enzima este complet saturată cu substrat

Viteza unei reacții enzimatice măsurată în condițiile de mai sus și saturația completă a enzimei cu substratul se numește viteza maximă de reacție enzimatică (V).

Viteza reacției enzimatice, determinată atunci când enzima nu este complet saturată cu substratul, se notează v.

Cataliza enzimatică poate fi simplificată prin următoarea diagramă:

unde F este o enzimă; S - substrat; FS - complex enzimatic-substrat.

Fiecare etapă a acestui proces este caracterizată de o anumită viteză. Unitatea de măsură pentru viteza unei reacții enzimatice este numărul de moli de substrat transformați pe unitatea de timp(la fel ca viteza unei reacții normale).

Interacțiunea enzimei cu substratul duce la formarea unui complex enzimă-substrat, dar acest proces este reversibil. Viteza reacțiilor directe și inverse depind de concentrațiile reactanților și sunt descrise prin ecuațiile corespunzătoare:

Într-o stare de echilibru, ecuația (6.3) este valabilă, deoarece vitezele reacțiilor directe și inverse sunt egale.

Înlocuind valorile vitezei reacțiilor înainte (6.1) și inversă (6.2) în ecuația (6.3), obținem egalitatea:

Starea de echilibru se caracterizează printr-o corespunzătoare constanta de echilibru K p, egal cu raportul constantelor reacțiilor directe și inverse (6.5). Se numește reciproca constantei de echilibru constanta substratului Ks, sau constanta de disociere a complexului enzimă-substrat:

Din ecuația (6.6) este clar că constanta substratului scade la concentrații mari ale complexului enzimă-substrat, adică. cu mare stabilitate. În consecință, constanta substratului caracterizează afinitatea enzimei și substratului și raportul constantelor de viteză pentru formarea și disocierea complexului enzimă-substrat.

Fenomenul de saturație enzimatică cu substrat a fost studiat de Leonor Michaelis și Maud Mepten. Pe baza prelucrării matematice a rezultatelor, au derivat ecuația (6.7), care și-a primit numele, din care este clar că la o concentrație mare de substrat și o valoare scăzută a constantei substratului, viteza reacției enzimatice tinde spre maxim. . Cu toate acestea, această ecuație este limitată deoarece nu ia în considerare toți parametrii:

Complexul enzimă-substrat în timpul reacției poate suferi transformări în diferite direcții:

• se disociază în substanțele părinte;
• se transformă într-un produs din care enzima este separată neschimbată.

Prin urmare, pentru a descrie acțiunea generală a procesului enzimatic, conceptul constantele Michaelis Kt, care exprimă relaţia dintre constantele de viteză ale tuturor celor trei reacţii ale catalizei enzimatice (6.8). Dacă ambii termeni sunt împărțiți la constanta vitezei de reacție pentru formarea complexului enzimă-substrat, obținem expresia (6.9):

Un corolar important rezultă din ecuația (6.9): constanta Michaelis este întotdeauna mai mare decât constanta substratului cu cantitatea k 2 /k v

Numeric K t egală cu concentrația substratului la care viteza de reacție este jumătate din viteza maximă posibilă și corespunde saturației enzimei cu substratul, ca în Fig. 6.5, b. Deoarece în practică nu este întotdeauna posibil să se obțină saturarea completă a enzimei cu substratul, este tocmai K t utilizat pentru caracterizarea comparativă a caracteristicilor cinetice ale enzimelor.

Viteza reacției enzimatice când enzima nu este complet saturată cu substratul (6.10) depinde de concentrația complexului enzimă-substrat. Coeficientul de proporționalitate este constanta de reacție pentru eliberarea enzimei și a produsului, deoarece aceasta modifică concentrația complexului enzimă-substrat:

După transformări, ținând cont de dependențele de mai sus, viteza reacției enzimatice atunci când enzima nu este complet saturată cu substratul este descrisă prin ecuația (6.11), i.e. depinde de concentrațiile enzimei, substratului și de afinitatea acestora K s:

Dependența grafică a vitezei unei reacții enzimatice de concentrația substratului nu este liniară. După cum este evident din fig. 6.6, odată cu creșterea concentrației de substrat, se observă o creștere a activității enzimatice. Cu toate acestea, când se atinge saturația maximă a enzimei cu substratul, viteza reacției enzimatice devine maximă. Prin urmare, factorul de limitare a vitezei pentru reacție este formarea unui complex enzimă-substrat.

Practica a arătat că concentrațiile de substrat, de regulă, sunt exprimate în valori mult mai mici decât unitate (10 6 -10 3 mol). Este destul de dificil să operați cu astfel de cantități în calcule. Prin urmare, G. Lineweaver și D. Burke au propus să exprime dependența grafică a vitezei unei reacții enzimatice nu în coordonate directe, ci în coordonate inverse. Ei au pornit de la presupunerea că, pentru cantități egale, inversele lor sunt de asemenea egale:

Orez. 6.6.

După transformarea expresiei (6.13), obținem o expresie numită Ecuația Lineweaver-Burk (6.14):

Dependența grafică a ecuației Lineweaver-Burk este liniară (Fig. 6.7). Caracteristicile cinetice ale enzimei sunt determinate după cum urmează:

• segmentul tăiat pe axa ordonatelor este egal cu 1/V;
• segmentul tăiat pe axa absciselor este egal cu -1 /La t.

Orez. 6.7.

Se crede că metoda Lineweaver-Burk face posibilă determinarea vitezei maxime de reacție mai precis decât în ​​coordonatele directe. Informații valoroase cu privire la inhibarea enzimelor pot fi, de asemenea, adunate din acest grafic.

Există și alte moduri de a transforma ecuația Michaelis-Menten. Dependențe grafice sunt folosite pentru a studia influența diferitelor influențe externe asupra procesului enzimatic.

A). Dependența vitezei de reacție enzimatică de cantitatea de enzime

Când o reacție enzimatică este efectuată în condiții de exces de substrat, viteza de reacție va depinde de concentrația enzimei. Dependența grafică a unei astfel de reacții are forma unei linii drepte.Cu toate acestea, cantitatea de enzimă este adesea imposibil de determinat în termeni absoluti, așa că în practică folosesc valori condiționate care caracterizează activitatea enzimei: o unitate internațională de activitatea (UI) corespunde cantității de enzimă care catalizează conversia a 1 µmol de substrat în 1 min în condiții optime pentru reacția enzimatică. Condițiile optime sunt individuale pentru fiecare enzimă și depind de temperatura mediului, pH-ul soluției, în absența activatorilor și inhibitorilor.

Dependența acumulării de produs (A) și a pierderii de substrat (B) de timpul (durata) reacției. Viteza unei reacții enzimatice este determinată de modificarea concentrației produsului sau substratului pe unitatea de timp. În reacțiile catalizate de enzimele 1 și 2, viteza inițială a reacției catalizate de enzima 1 este mai mică decât viteza reacției catalizate de enzima 2, deoarece tangentei tangentei la curba profilului de reacție trasă din punctul „O” a celei de-a doua enzime este mai mare, ca în cazul acumulării de produs (A) și pierderii substratului (B). Viteza în orice moment t este determinată de tangenta tangentei la profilul de reacție la momentul t. Perioada de timp a unei reacții enzimatice este caracterizată printr-o acumulare liniară de produs (sau pierdere de substrat) în funcție de durata reacției. Perioada unei reacții enzimatice este caracterizată printr-o acumulare neliniară de produs (sau pierdere de substrat) în funcție de timpul de reacție.

Numărul de unități de activitate nME este determinat de formula:

B). Dependența vitezei de reacție enzimatică de temperatura mediului

Creșterea temperaturii până la anumite limite afectează rata enzimatică

reacția este similară cu efectul temperaturii asupra oricărei reacții chimice. Pe măsură ce temperatura crește, mișcarea moleculelor se accelerează, ceea ce duce la o creștere a probabilității de interacțiune între reactanți. În plus, temperatura poate crește energia moleculelor care reacţionează, ceea ce accelerează, de asemenea, reacția. Cu toate acestea, viteza unei reacții chimice catalizate de enzime are propriul optim de temperatură, al cărei exces este însoțit de o scădere a activității enzimatice rezultată din denaturarea termică a moleculei proteice.

Pentru majoritatea enzimelor umane, temperatura optimă este de 37-38 °C. Cu toate acestea, enzimele termostabile există și în natură. De exemplu, polimeraza Taq izolată din microorganismele care trăiesc în izvoarele termale nu este inactivată atunci când temperatura crește la 95 °C. Această enzimă este utilizată în medicina științifică și practică pentru diagnosticul molecular al bolilor folosind metoda reacției în lanț a polimerazei (PCR).

ÎN). Dependența vitezei de reacție enzimatică de cantitatea de substrat

Pe măsură ce cantitatea de substrat crește, viteza inițială crește. Când enzima devine complet saturată cu substrat, de ex. formarea maximă posibilă a unui complex enzimă-substrat are loc la o concentrație de enzimă dată și se observă cea mai mare rată de formare a produsului. O creștere suplimentară a concentrației substratului nu duce la o creștere a formării produsului, de exemplu. viteza de reacție nu crește. Această stare corespunde vitezei maxime de reacție Vmax.

Astfel, concentrația enzimatică este factorul limitator în formarea produsului. Această observație a stat la baza cineticii enzimatice dezvoltată de oamenii de știință L. Michaelis și M. Menten în 1913.

Viteza de reacție este proporțională cu concentrația complexului ES enzimă-substrat, iar viteza de formare a ES depinde de concentrația de substrat și de concentrația de enzimă liberă. Concentrația de ES este afectată de rata de formare și dezintegrare a ES.

Cea mai mare viteză de reacție este observată atunci când toate moleculele de enzimă sunt în complex cu substratul, adică. în complexul enzimă-substrat ES, adică. [E] = .

Dependența vitezei unei reacții enzimatice de concentrația substratului este exprimată prin următoarea ecuație (derivarea matematică a acestei formule poate fi găsită în manualele de cinetică enzimatică):

V = Vmax[S] / Km + [S]

Această ecuație se numește ecuația Michaelis-Menten.

Ecuația Michaelis-Menten este ecuația de bază a cineticii enzimatice, care descrie dependența vitezei unei reacții enzimatice de concentrația substratului.

Dacă concentrația substratului este semnificativ mai mare decât Km (S >> Km), atunci o creștere a concentrației substratului cu valoarea Km nu are practic niciun efect asupra sumei (Km + S) și poate fi considerată egală cu concentrația substratului . În consecință, viteza de reacție devine egală cu viteza maximă: V = Vmax. În aceste condiții, reacția are ordine zero, adică. nu depinde de concentrația substratului. Putem concluziona că Vmax este o valoare constantă pentru o anumită concentrație de enzimă, independent de concentrația de substrat.

Dacă concentrația substratului este semnificativ mai mică decât Km(S<< Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Vmax și Km sunt caracteristici cinetice ale eficienței enzimatice.

Vmax caracterizează activitatea catalitică a enzimei și are dimensiunea vitezei reacției enzimatice mol/l, adică. determină posibilitatea maximă de formare a produsului la o concentrație de enzimă dată și în condiții de exces de substrat. Km caracterizează afinitatea unei enzime date pentru un substrat dat și este o valoare constantă care nu depinde de concentrația enzimei. Cu cât Km este mai mic, cu atât este mai mare afinitatea enzimei pentru un anumit substrat, cu atât viteza de reacție inițială este mai mare și invers, cu cât Km este mai mare, cu atât viteza de reacție inițială este mai mică, cu atât afinitatea enzimei pentru substrat este mai mică.

Această ramură a enzimologiei studiază influența diverșilor factori asupra vitezei unei reacții enzimatice. Luând în considerare ecuația generală pentru cataliza enzimatică a reacției reversibile de conversie a unui substrat într-un singur produs (1),

Principalii factori care influențează viteza unei reacții enzimatice ar trebui numiți: concentrația substratului [S], concentrația enzimei [E] și concentrația produsului de reacție [P].

Interacțiunea unor enzime cu substratul lor poate fi descrisă printr-o curbă hiperbolică a dependenței vitezei de reacție enzimatică V de concentrația substratului [S] (Fig. 19):

Fig. 19. Dependenţa vitezei de reacţie enzimatică de concentraţia substratului.

Pe această curbă se pot distinge trei secțiuni, care pot fi explicate prin prevederile mecanismului de interacțiune a enzimei cu substratul: OA - o secțiune de dependență direct proporțională a lui V de [S], centrii activi ai enzimei. sunt umplute treptat cu molecule de substrat cu formarea unui complex ES instabil; secțiunea AB - dependența curbilinie a lui V de [S], saturația completă a centrilor activi ai enzimei cu molecule de substrat nu a fost încă atinsă. Complexul ES este instabil înainte de a ajunge la starea de tranziție, probabilitatea de disociere inversă la E și S este încă mare; secțiunea BC - dependența este descrisă printr-o ecuație de ordinul zero, secțiunea este paralelă cu axa [S], s-a realizat saturația completă a enzimelor active cu molecule de substrat, V=V max.

Forma caracteristică a curbei este descrisă matematic de ecuația Briggs-Haldane:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

unde Km este constanta Michaelis-Menten, numeric egală cu concentrația substratului la care viteza reacției enzimatice este egală cu jumătate de V max.

Cu cât este mai mic Km al enzimei, cu atât este mai mare afinitatea enzimei pentru substrat, cu atât mai rapid este atinsă starea de tranziție pentru substrat și se transformă într-un produs de reacție. Găsirea valorilor Km pentru fiecare substrat enzimatic specific grupului este importantă în determinarea rolului biologic al acestei enzime în celulă.

Pentru majoritatea enzimelor este imposibilă construirea unei curbe hiperbolice (Fig. 19).În acest caz, se utilizează metoda dublelor reciproce (Lineweaver-Burk), adică. este reprezentată grafic o dependență de 1/[V] față de 1/[S] (Fig. 20). Metoda de construire a unor astfel de curbe într-un experiment este foarte convenabilă atunci când se studiază efectul diferitelor tipuri de inhibitori asupra activității enzimelor (a se vedea mai departe în text).

Fig.20. Graficul 1/[V] versus 1/[S] (metoda Lineweaver-Burk),

unde y este secțiunea de tăiere - și x este secțiunea de tăiere - , tangenta unghiului α - .

Dependența vitezei reacției enzimatice V de concentrația enzimei [E].

Această dependență grafică (Fig. 21) este considerată la temperatura și pH-ul optim al mediului, la concentrații de substrat semnificativ mai mari decât concentrația de saturație a centrilor activi ai enzimei.

Orez. 21. Influența concentrației enzimatice asupra vitezei de reacție enzimatică.

Dependența vitezei unei reacții enzimatice de concentrația unui cofactor sau coenzimă. Pentru enzimele complexe, trebuie luat în considerare faptul că o deficiență a formelor coenzimatice de vitamine în caz de hipovitaminoză și o încălcare a aportului de ioni metalici în organism duc în mod necesar la o scădere a concentrației enzimelor corespunzătoare necesare cursului. a proceselor metabolice. Prin urmare, trebuie concluzionat că activitatea enzimei este direct dependentă de concentrația cofactorului sau coenzimei.

Influența concentrației produsului asupra vitezei de reacție enzimatică. Pentru reacțiile reversibile care apar în corpul uman, trebuie luat în considerare faptul că produsele reacției directe pot fi utilizate de enzimă ca substraturi pentru reacția inversă. Prin urmare, direcția curgerii și momentul atingerii Vmax depind de raportul dintre concentrațiile substraturilor inițiale și ale produselor de reacție. De exemplu, activitatea alanin aminotransferazei, care catalizează transformarea:

Alanină + Alfa-cetoglutarat ↔ Piruvat + Glutamat

depinde în celulă de raportul de concentrație:

[alanina + alfa-cetoglutarat] / [piruvat + glutamat].

MECANISMUL DE ACȚIUNE A ENZIMELOR. TEORII ALE CATALIZEI ENZIMICE

Enzimele, precum catalizatorii non-proteici, cresc viteza unei reacții chimice datorită capacității lor de a reduce energia de activare a acestei reacții. Energia de activare a unei reacții enzimatice este calculată ca diferența dintre valoarea energiei din sistem a reacției în curs care a atins starea de tranziție și energia determinată la începutul reacției (vezi dependența grafică din Fig. 22).

Orez. 22. Dependența grafică a stării energetice a unei reacții chimice fără o enzimă (1) și în prezența unei enzime (2) de timpul de reacție.

Lucrările lui V. Henry și, în special, a lui L. Michaelis, M. Menten privind studierea mecanismului reacțiilor enzimatice reversibile monosubstrate au făcut posibilă postularea că enzima E se combină mai întâi reversibil și relativ rapid cu substratul său S pentru a forma o enzimă- complex de substrat (ES):

E+S<=>ES (1)

Formarea ES are loc datorită legăturilor de hidrogen, interacțiunilor electrostatice, hidrofobe, în unele cazuri covalente, legăturilor de coordonare între radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi ai centrului activ și grupările funcționale ale substratului. În enzimele complexe, funcția de contact cu substratul poate fi îndeplinită și de partea neproteică a structurii.

Complexul enzimă-substrat se dezintegrează apoi într-o a doua reacție, mai lentă, reversibilă pentru a produce produsul de reacție P și enzima liberă E:

ES<=>EP<=>E+P (2)

În prezent, datorită muncii oamenilor de știință menționați mai sus, precum și a Keilin D., Chance B., Koshland D. (teoria „corespondenței induse”), există prevederi teoretice despre patru puncte principale în mecanismul de acțiune a unei enzime pe un substrat, care determină capacitatea enzimelor de a accelera reacțiile chimice:

1. Orientare și abordare . Enzima este capabilă să lege o moleculă de substrat în așa fel încât legătura atacată de enzimă să fie situată nu numai în imediata apropiere a grupării catalitice, ci și orientată corect față de aceasta. Probabilitatea ca complexul ES să ajungă la starea de tranziție prin orientare și proximitate este mult crescută.

2. Stresul și încordarea : corespondență indusă. Atașarea unui substrat poate provoca modificări conformaționale ale moleculei de enzimă, care duc la tensiune în structura centrului activ și, de asemenea, deformează oarecum substratul legat, facilitând astfel atingerea unei stări de tranziție de către complexul ES. Între moleculele E și S apare așa-numita corespondență indusă.

Pe măsură ce temperatura mediului crește, viteza reacției enzimatice crește, atingând un maxim la o temperatură optimă și apoi scade la zero. Pentru reacțiile chimice, există o regulă că atunci când temperatura crește cu 10°C, viteza de reacție crește de două până la trei ori. Pentru reacțiile enzimatice, acest coeficient de temperatură este mai mic: la fiecare 10°C, viteza de reacție crește de 2 ori sau chiar mai puțin. Scăderea ulterioară a vitezei de reacție la zero indică denaturarea blocului enzimatic. Valorile optime de temperatură pentru majoritatea enzimelor sunt în intervalul 20 - 40 0 ​​C. Termolabilitatea enzimelor este asociată cu structura lor proteică. Unele enzime sunt denaturate deja la o temperatură de aproximativ 40 0 ​​C, dar cea mai mare parte a acestora este inactivată la temperaturi peste 40 - 50 0 C. Unele enzime sunt inactivate de frig, de exemplu. la temperaturi apropiate de 0°C are loc denaturarea.

O creștere a temperaturii corpului (febra) accelerează reacțiile biochimice catalizate de enzime. Este ușor de calculat că fiecare grad de creștere a temperaturii corpului crește viteza de reacție cu aproximativ 20%. La temperaturi ridicate de aproximativ 39-40°C, utilizarea risipitoare a substraturilor endogene din celulele unui organism bolnav trebuie completată cu alimente. În plus, la o temperatură de aproximativ 40°C, unele enzime foarte termolabile pot fi denaturate, ceea ce perturbă cursul natural al proceselor biochimice.

Temperatura scăzută determină inactivarea reversibilă a enzimelor din cauza unei ușoare modificări în structura sa spațială, dar suficientă pentru a perturba configurația corespunzătoare a centrului activ și a moleculelor de substrat.

Dependența vitezei de reacție de pH-ul mediului

Majoritatea enzimelor au o valoare specifică a pH-ului la care activitatea lor este cea mai mare; Peste și sub această valoare a pH-ului, activitatea acestor enzime scade. Cu toate acestea, nu în toate cazurile curbele care descriu dependența activității enzimelor de pH sunt în formă de clopot; uneori această dependenţă poate fi exprimată şi direct. Dependența vitezei unei reacții enzimatice de pH indică în principal starea grupelor funcționale ale centrului activ al enzimei. O modificare a pH-ului mediului afectează ionizarea grupurilor acide și bazice ale reziduurilor de aminoacizi ale centrului activ, care sunt implicate fie în legarea substratului (în locul de contact), fie în transformarea acestuia (în situsul catalitic). ). Prin urmare, efectul specific al pH-ului poate fi cauzat fie de o modificare a afinității substratului pentru enzimă, fie de o modificare a activității catalitice a enzimei, sau ambele motive împreună.

Majoritatea substraturilor au grupe acide sau bazice, deci pH-ul afectează gradul de ionizare al substratului. Enzima se leagă de preferință la forma ionizată sau neionizată a substratului. Evident, la pH optim, grupările funcționale ale situsului activ sunt în starea cea mai reactivă, iar substratul este într-o formă preferată pentru legarea de către aceste grupări enzimatice.

Atunci când se construiesc curbe care descriu dependența activității enzimei de pH, măsurătorile la toate valorile pH-ului sunt de obicei efectuate în condiții de saturație a enzimei cu substratul, deoarece valoarea Km pentru multe enzime se modifică odată cu modificările pH-ului.

Curba care caracterizează dependența activității enzimatice de pH poate avea o formă deosebit de simplă în cazurile în care enzima acționează pe substraturi neutre electrostatic sau substraturi în care grupările încărcate nu joacă un rol semnificativ în actul catalitic. Un exemplu de astfel de enzime este papaina, precum și invertaza, care catalizează hidroliza moleculelor neutre de zaharoză și menține activitatea constantă în intervalul de pH 3,0-7,5.

Valoarea pH-ului corespunzătoare activității enzimatice maxime nu coincide neapărat cu valoarea pH-ului caracteristică mediului intracelular normal al acestei enzime; acesta din urmă poate fi atât peste cât și sub pH-ul optim. Acest lucru sugerează că efectul pH-ului asupra activității enzimatice poate fi unul dintre factorii responsabili pentru reglarea activității enzimatice în interiorul celulei. Deoarece celula conține sute de enzime și fiecare dintre ele reacționează diferit la modificările pH-ului, valoarea pH-ului din interiorul celulei este poate unul dintre elementele importante în sistemul complex de reglare a metabolismului celular.