Ako nastaviť rýchlosť enzymatickej reakcie. Závislosť rýchlosti enzymatických reakcií od koncentrácie substrátov, enzýmov a teploty. Špecifiká procesov s jedným substrátom

§ 12. KINETIKA ENZYMATÍVNYCH REAKCIÍ

Kinetika enzymatických reakcií je veda o rýchlostiach enzymatických reakcií a ich závislosti od rôznych faktorov. Rýchlosť enzymatickej reakcie je určená chemickým množstvom zreagovaného substrátu alebo výsledného reakčného produktu za jednotku času na jednotku objemu za určitých podmienok:

kde v je rýchlosť enzymatickej reakcie, je zmena koncentrácie substrátu alebo reakčného produktu, t je čas.

Rýchlosť enzymatickej reakcie závisí od povahy enzýmu, ktorá určuje jeho aktivitu. Čím vyššia je aktivita enzýmu, tým rýchlejšia je rýchlosť reakcie. Aktivita enzýmu je určená rýchlosťou reakcie katalyzovanej enzýmom. Meradlom aktivity enzýmu je jedna štandardná jednotka aktivity enzýmu. Jedna štandardná jednotka aktivity enzýmu je množstvo enzýmu, ktoré katalyzuje konverziu 1 µmol substrátu za 1 minútu.

Počas enzymatickej reakcie enzým (E) interaguje so substrátom (S), čo vedie k vytvoreniu komplexu enzým-substrát, ktorý sa potom rozpadne a uvoľní enzým a produkt (P) reakcie:

Rýchlosť enzymatickej reakcie závisí od mnohých faktorov: od koncentrácie substrátu a enzýmu, od teploty, od pH prostredia, od prítomnosti rôznych regulačných látok, ktoré môžu zvyšovať alebo znižovať aktivitu enzýmov.

Zaujímavé vedieť! Enzýmy sa v medicíne používajú na diagnostiku rôznych chorôb. Pri infarkte myokardu sa v dôsledku poškodenia a rozpadu srdcového svalu prudko zvyšuje obsah enzýmov aspartáttransamináz a alanínaminotransferázy v krvi. Detekcia ich aktivity umožňuje diagnostikovať túto chorobu.

Vplyv koncentrácie substrátu a enzýmu na rýchlosť enzymatickej reakcie

Uvažujme vplyv koncentrácie substrátu na rýchlosť enzymatickej reakcie (obr. 30). Pri nízkych koncentráciách substrátu je rýchlosť priamo úmerná jeho koncentrácii, potom, keď sa koncentrácia zvyšuje, rýchlosť reakcie sa zvyšuje pomalšie a pri veľmi vysokých koncentráciách substrátu je rýchlosť prakticky nezávislá od jeho koncentrácie a dosahuje svoju hodnotu; maximálna hodnota (V max). Pri takýchto koncentráciách substrátu sú všetky molekuly enzýmu súčasťou komplexu enzým-substrát a dosiahne sa úplná saturácia aktívnych centier enzýmu, preto je rýchlosť reakcie v tomto prípade prakticky nezávislá od koncentrácie substrátu.

Ryža. 30. Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu

Graf závislosti aktivity enzýmu od koncentrácie substrátu popisuje rovnica Michaelis-Menten, ktorá dostala svoje meno na počesť vynikajúcich vedcov L. Michaelisa a M. Mentena, ktorí významne prispeli k štúdiu kinetiky enzymatické reakcie,

kde v je rýchlosť enzymatickej reakcie; [S] – koncentrácia substrátu; K M – Michaelisova konštanta.

Uvažujme o fyzickom význame Michaelisovej konštanty. Za predpokladu, že v = ½ V max , dostaneme K M = [S]. Michaelisova konštanta sa teda rovná koncentrácii substrátu, pri ktorej je rýchlosť reakcie polovičná.

Rýchlosť enzymatickej reakcie závisí aj od koncentrácie enzýmu (obr. 31). Táto závislosť je priamočiara.

Ryža. 31. Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie enzýmu

Vplyv teploty na rýchlosť enzymatickej reakcie

Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od teploty je znázornená na obr. 32.

Ryža. 32. Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od teploty.

Pri nízkych teplotách (približne do 40 - 50 o C) je zvýšenie teploty o každých 10 o C podľa Van't Hoffovho pravidla sprevádzané zvýšením rýchlosti chemickej reakcie 2 - 4 krát. Pri vysokých teplotách nad 55 - 60 o C aktivita enzýmu prudko klesá v dôsledku jeho tepelnej denaturácie a v dôsledku toho sa pozoruje prudký pokles rýchlosti enzymatickej reakcie. Maximálna aktivita enzýmu sa zvyčajne pozoruje v rozmedzí 40 - 60 o C. Teplota, pri ktorej je aktivita enzýmu maximálna, sa nazýva teplotné optimum. Teplotné optimum pre enzýmy termofilných mikroorganizmov je v oblasti vyšších teplôt.

Vplyv pH na rýchlosť enzymatickej reakcie

Závislosť enzymatickej aktivity od pH je znázornená na obr. 33.

Ryža. 33. Vplyv pH na rýchlosť enzymatickej reakcie

Graf pH má tvar zvona. Hodnota pH, pri ktorej je aktivita enzýmu maximálna, sa nazýva pH optimum enzým. Optimálne hodnoty pH pre rôzne enzýmy sa značne líšia.

Povaha závislosti enzymatickej reakcie od pH je určená skutočnosťou, že tento indikátor ovplyvňuje:

a) ionizácia aminokyselinových zvyškov podieľajúcich sa na katalýze,

b) ionizácia substrátu,

c) konformácia enzýmu a jeho aktívneho centra.

Inhibícia enzýmov

Rýchlosť enzymatickej reakcie môže znížiť množstvo chemikálií tzv inhibítory. Niektoré inhibítory sú pre ľudí jedy, napríklad kyanid, iné sa používajú ako lieky.

Inhibítory možno rozdeliť do dvoch hlavných typov: nezvratné A reverzibilné. Ireverzibilné inhibítory (I) sa viažu na enzým a vytvárajú komplex, ktorého disociácia s obnovením aktivity enzýmu nie je možná:

Príkladom ireverzibilného inhibítora je diizopropylfluórfosfát (DFP). DPP inhibuje enzým acetylcholínesterázu, ktorý hrá dôležitú úlohu pri prenose nervových vzruchov. Tento inhibítor interaguje so serínom v aktívnom centre enzýmu, čím blokuje jeho aktivitu. V dôsledku toho je narušená schopnosť procesov nervových buniek neurónov viesť nervové impulzy. DPP je jedným z prvých nervových látok. Na jej základe vzniklo množstvo produktov, ktoré sú relatívne netoxické pre ľudí a zvieratá. insekticídy - látky jedovaté pre hmyz.

Reverzibilné inhibítory, na rozdiel od ireverzibilných, možno za určitých podmienok ľahko oddeliť od enzýmu. Činnosť druhého sa obnoví:

Reverzibilné inhibítory zahŕňajú konkurencieschopný A nesúťažný inhibítory.

Kompetitívny inhibítor, ktorý je štrukturálnym analógom substrátu, interaguje s aktívnym centrom enzýmu a tým blokuje prístup substrátu k enzýmu. V tomto prípade inhibítor nepodlieha chemickým transformáciám a viaže sa na enzým reverzibilne. Po disociácii EI komplexu môže enzým kontaktovať buď substrát a previesť ho, alebo inhibítor (obr. 34). Pretože substrát aj inhibítor súťažia o priestor na aktívnom mieste, takáto inhibícia sa nazýva kompetitívna inhibícia.

Ryža. 34. Mechanizmus účinku kompetitívneho inhibítora.

V medicíne sa používajú kompetitívne inhibítory. Sulfónamidové lieky boli predtým široko používané na boj proti infekčným chorobám. Štruktúrou sú blízko k kyselina para-aminobenzoová(PABA), nevyhnutný rastový faktor pre mnohé patogénne baktérie. PABA je prekurzorom kyseliny listovej, ktorá slúži ako kofaktor pre niekoľko enzýmov. Sulfónamidové lieky pôsobia ako kompetitívny inhibítor enzýmov na syntézu kyseliny listovej z PABA a tým inhibujú rast a reprodukciu patogénnych baktérií.

Nekompetitívne inhibítory nie sú štruktúrne podobné substrátu a keď sa vytvorí EI, neinteragujú s aktívnym centrom, ale s iným miestom enzýmu. Interakcia inhibítora s enzýmom vedie k zmene jeho štruktúry. Tvorba EI komplexu je reverzibilná, preto je enzým po jeho rozpade opäť schopný atakovať substrát (obr. 35).

Ryža. 35. Mechanizmus účinku nekompetitívneho inhibítora

Kyanid CN – môže pôsobiť ako nekompetitívny inhibítor. Viaže sa na kovové ióny, ktoré sú súčasťou prostetických skupín a inhibuje aktivitu týchto enzýmov. Otrava kyanidom je mimoriadne nebezpečná. Môžu byť smrteľné.

Alosterické enzýmy

Výraz „alosterický“ pochádza z gréckych slov allo – iné, stereo – miesto. Alosterické enzýmy teda spolu s aktívnym centrom majú ďalšie centrum tzv alosterické centrum(obr. 36). Látky, ktoré môžu meniť aktivitu enzýmov sa viažu na alosterické centrum, tieto látky sú tzv alosterické efektory. Efektory sú pozitívne – aktivujúce enzým, a negatívne – inhibujúce, t.j. zníženie aktivity enzýmov. Niektoré alosterické enzýmy môžu byť ovplyvnené dvoma alebo viacerými efektormi.

Ryža. 36. Štruktúra alosterického enzýmu.

Regulácia multienzýmových systémov

Niektoré enzýmy pôsobia spoločne a spájajú sa do multienzýmových systémov, v ktorých každý enzým katalyzuje špecifickú fázu metabolickej dráhy:

V multienzýmovom systéme existuje enzým, ktorý určuje rýchlosť celého sledu reakcií. Tento enzým je zvyčajne alosterický a nachádza sa na začiatku metabolitovej dráhy. Je schopný prijímaním rôznych signálov zvyšovať aj znižovať rýchlosť katalyzovanej reakcie, čím reguluje rýchlosť celého procesu.

Enzýmová kinetika študuje rýchlosť reakcií katalyzovaných enzýmami v závislosti od rôznych podmienok (koncentrácia, teplota, pH atď.) ich interakcie so substrátom.

Enzýmy sú však bielkoviny, ktoré sú citlivé na vplyv rôznych vonkajších vplyvov. Preto pri štúdiu rýchlosti enzymatických reakcií berú do úvahy najmä koncentrácie reagujúcich látok a snažia sa minimalizovať vplyv teploty, pH prostredia, aktivátorov, inhibítorov a iných faktorov a vytvárať štandardné podmienky. Po prvé, je to hodnota pH prostredia, ktorá je optimálna pre daný enzým. Po druhé, tam, kde je to možné, sa odporúča udržiavať teplotu 25 °C. Po tretie, dosiahne sa úplné nasýtenie enzýmu substrátom. Tento bod je obzvlášť dôležitý, pretože pri nízkych koncentráciách substrátu sa na reakcii nezúčastňujú všetky molekuly enzýmu (obr. 6.5, A), čo znamená, že výsledok bude ďaleko od maximálneho možného. Najväčšia sila katalyzovanej reakcie, pričom ostatné veci sú rovnaké, sa dosiahne, ak sa každá molekula enzýmu zúčastní transformácie, t.j. pri vysokej koncentrácii komplexu enzým-substrát (obr. 6.5, V). Ak koncentrácia substrátu nezabezpečí úplné nasýtenie enzýmu (obr. 6.5, b), potom rýchlosť reakcie nedosiahne svoju maximálnu hodnotu.

Ryža. 65.

A - pri nízkej koncentrácii substrátu; 6 - s nedostatočnou koncentráciou substrátu; V - keď je enzým úplne nasýtený substrátom

Rýchlosť enzymatickej reakcie meraná za vyššie uvedených podmienok a úplné nasýtenie enzýmu substrátom sa nazýva maximálna rýchlosť enzymatickej reakcie (V).

Označuje sa rýchlosť enzymatickej reakcie, stanovená, keď enzým nie je úplne nasýtený substrátom v.

Enzýmovú katalýzu je možné zjednodušiť pomocou nasledujúceho diagramu:

kde F je enzým; S - substrát; FS - komplex enzým-substrát.

Každá fáza tohto procesu sa vyznačuje určitou rýchlosťou. Jednotkou merania rýchlosti enzymatickej reakcie je počet mólov substrátu prevedených za jednotku času(rovnaká ako rýchlosť normálnej reakcie).

Interakcia enzýmu so substrátom vedie k vytvoreniu komplexu enzým-substrát, tento proces je však reverzibilný. Rýchlosti priamych a spätných reakcií závisia od koncentrácií reaktantov a sú opísané zodpovedajúcimi rovnicami:

V rovnovážnom stave platí rovnica (6.3), pretože rýchlosti priamych a spätných reakcií sú rovnaké.

Dosadením hodnôt rýchlosti doprednej (6.1) a spätnej (6.2) reakcie do rovnice (6.3) dostaneme rovnosť:

Rovnovážny stav je charakterizovaný primeraným rovnovážna konštanta Kp, rovná pomeru konštánt priamej a spätnej reakcie (6.5). Prevrátená hodnota rovnovážnej konštanty sa nazýva substrátová konštanta Ks, alebo disociačná konštanta komplexu enzým-substrát:

Z rovnice (6.6) je zrejmé, že substrátová konštanta pri vysokých koncentráciách komplexu enzým-substrát klesá, t.j. s veľkou stabilitou. Substrátová konštanta teda charakterizuje afinitu enzýmu a substrátu a pomer rýchlostných konštánt pre tvorbu a disociáciu komplexu enzým-substrát.

Fenomén nasýtenia enzýmov substrátom študovali Leonor Michaelis a Maud Mepten. Na základe matematického spracovania výsledkov odvodili rovnicu (6.7), ktorá dostala svoje názvy, z ktorej je zrejmé, že pri vysokej koncentrácii substrátu a nízkej hodnote substrátovej konštanty má rýchlosť enzymatickej reakcie tendenciu k max. . Táto rovnica je však obmedzená, pretože neberie do úvahy všetky parametre:

Komplex enzým-substrát môže počas reakcie prejsť transformáciou v rôznych smeroch:

• disociovať na materské látky;
• transformovať na produkt, z ktorého sa enzým oddelí nezmenený.

Preto, aby sme opísali celkové pôsobenie enzymatického procesu, koncept Michaelisove konštanty Kt, ktorý vyjadruje vzťah medzi rýchlostnými konštantami všetkých troch reakcií enzymatickej katalýzy (6.8). Ak sú oba členy delené konštantou reakčnej rýchlosti pre tvorbu komplexu enzým-substrát, dostaneme výraz (6.9):

Z rovnice (6.9) vyplýva dôležitý dôsledok: Michaelisova konštanta je vždy väčšia ako substrátová konštanta o množstvo k 2 /k v

Číselne K t rovná koncentrácii substrátu, pri ktorej je reakčná rýchlosť polovičná oproti maximálnej možnej rýchlosti a zodpovedá nasýteniu enzýmu substrátom, ako na obr. 6,5, b. Pretože v praxi nie je vždy možné dosiahnuť úplné nasýtenie enzýmu substrátom, je to presne tak K t používa sa na porovnávaciu charakterizáciu kinetických charakteristík enzýmov.

Rýchlosť enzymatickej reakcie, keď enzým nie je úplne nasýtený substrátom (6.10), závisí od koncentrácie komplexu enzým-substrát. Koeficient proporcionality je reakčná konštanta pre uvoľňovanie enzýmu a produktu, pretože to mení koncentráciu komplexu enzým-substrát:

Po transformáciách, berúc do úvahy vyššie uvedené závislosti, je rýchlosť enzymatickej reakcie, keď enzým nie je úplne nasýtený substrátom, opísaná rovnicou (6.11), t.j. závisí od koncentrácií enzýmu, substrátu a ich afinity K s:

Grafická závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu nie je lineárna. Ako je zrejmé z obr. 6.6, so zvyšujúcou sa koncentráciou substrátu sa pozoruje zvýšenie aktivity enzýmu. Keď sa však dosiahne maximálna saturácia enzýmu substrátom, rýchlosť enzymatickej reakcie sa stane maximálnou. Faktorom limitujúcim rýchlosť reakcie je preto tvorba komplexu enzým-substrát.

Prax ukázala, že koncentrácie substrátu sú spravidla vyjadrené v hodnotách oveľa menších ako jednota (106 -103 mol). Vo výpočtoch je dosť ťažké operovať s takýmito veličinami. Preto G. Lineweaver a D. Burke navrhli vyjadriť grafickú závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie nie v priamych súradniciach, ale v inverzných. Vychádzali z predpokladu, že pre rovnaké množstvá sú rovnaké aj ich inverzné hodnoty:

Ryža. 6.6.

Po transformácii výrazu (6.13) získame výraz tzv Lineweaver-Burk rovnica (6.14):

Grafická závislosť Lineweaver-Burkovej rovnice je lineárna (obr. 6.7). Kinetické charakteristiky enzýmu sa určujú takto:

• segment odrezaný na zvislej osi sa rovná 1/V;
• segment odrezaný na osi x sa rovná -1 /Do t.

Ryža. 6.7.

Predpokladá sa, že metóda Lineweaver-Burk umožňuje určiť maximálnu rýchlosť reakcie presnejšie ako v priamych súradniciach. Z tohto grafu možno tiež získať cenné informácie týkajúce sa inhibície enzýmov.

Existujú aj iné spôsoby transformácie rovnice Michaelis-Menten. Grafické závislosti sa využívajú na štúdium vplyvu rôznych vonkajších vplyvov na enzymatický proces.

A). Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od množstva enzýmov

Keď sa enzymatická reakcia uskutočňuje v podmienkach prebytku substrátu, rýchlosť reakcie bude závisieť od koncentrácie enzýmu. Grafická závislosť takejto reakcie má tvar priamky, množstvo enzýmu je však často nemožné určiť v absolútnom vyjadrení, takže v praxi sa používajú podmienené hodnoty charakterizujúce aktivitu enzýmu: jedna medzinárodná jednotka. aktivita (IU) zodpovedá množstvu enzýmu, ktorý katalyzuje premenu 1 µmol substrátu za 1 minútu za optimálnych podmienok pre enzymatickú reakciu. Optimálne podmienky sú pre každý enzým individuálne a závisia od teploty prostredia, pH roztoku, v neprítomnosti aktivátorov a inhibítorov.

Závislosť akumulácie produktu (A) a straty substrátu (B) od času (trvania) reakcie. Rýchlosť enzymatickej reakcie je určená zmenou koncentrácie produktu alebo substrátu za jednotku času. Pri reakciách katalyzovaných enzýmami 1 a 2 je počiatočná rýchlosť reakcie katalyzovanej enzýmom 1 nižšia ako rýchlosť reakcie katalyzovanej enzýmom 2, pretože tangens dotyčnice ku krivke reakčného profilu nakreslenej z bodu "O" druhého enzýmu je vyššia, ako v prípade akumulácie produktu (A) a straty substrátu (B). Rýchlosť v ľubovoľnom čase t je určená dotyčnicou dotyčnice k reakčnému profilu v čase t. Časové obdobie enzymatickej reakcie je charakterizované lineárnou akumuláciou produktu (alebo stratou substrátu) v závislosti od trvania reakcie. Obdobie enzymatickej reakcie je charakterizované nelineárnou akumuláciou produktu (alebo stratou substrátu) v závislosti od reakčného času.

Počet jednotiek aktivity nME je určený vzorcom:

B). Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od teploty média

Zvýšenie teploty na určité hranice ovplyvňuje rýchlosť enzymatického

reakcia je podobná vplyvu teploty na akúkoľvek chemickú reakciu. So zvyšujúcou sa teplotou sa zrýchľuje pohyb molekúl, čo vedie k zvýšeniu pravdepodobnosti interakcie medzi reaktantmi. Navyše teplota môže zvýšiť energiu reagujúcich molekúl, čo tiež urýchli reakciu. Rýchlosť chemickej reakcie katalyzovanej enzýmami má však svoje teplotné optimum, ktorého prebytok je sprevádzaný znížením enzymatickej aktivity v dôsledku tepelnej denaturácie molekuly proteínu.

Pre väčšinu ľudských enzýmov je optimálna teplota 37-38 °C. Termostabilné enzýmy však existujú aj v prírode. Napríklad Taq polymeráza izolovaná z mikroorganizmov žijúcich v horúcich prameňoch nie je inaktivovaná, keď teplota stúpne na 95 °C. Tento enzým sa používa vo vedeckej a praktickej medicíne na molekulárnu diagnostiku chorôb pomocou metódy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).

IN). Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od množstva substrátu

So zvyšujúcim sa množstvom substrátu sa zvyšuje počiatočná rýchlosť. Keď sa enzým úplne nasýti substrátom, t.j. maximálna možná tvorba komplexu enzým-substrát nastáva pri danej koncentrácii enzýmu a pozoruje sa najvyššia rýchlosť tvorby produktu. Ďalšie zvýšenie koncentrácie substrátu nevedie k zvýšeniu tvorby produktu, t.j. reakčná rýchlosť sa nezvýši. Tento stav zodpovedá maximálnej rýchlosti reakcie Vmax.

Koncentrácia enzýmu je teda limitujúcim faktorom pri tvorbe produktu. Toto pozorovanie vytvorilo základ enzýmovej kinetiky vyvinutej vedcami L. Michaelisom a M. Mentenom v roku 1913.

Reakčná rýchlosť je úmerná koncentrácii komplexu ES enzým-substrát a rýchlosť tvorby ES závisí od koncentrácie substrátu a koncentrácie voľného enzýmu. Koncentrácia ES je ovplyvnená rýchlosťou tvorby a rozpadu ES.

Najvyššia reakčná rýchlosť sa pozoruje, keď sú všetky molekuly enzýmu v komplexe so substrátom, t.j. v komplexe enzým-substrát ES, t.j. [E] = .

Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu vyjadruje nasledujúca rovnica (matematické odvodenie tohto vzorca možno nájsť v učebniciach enzymatickej kinetiky):

V = Vmax[S] / Km + [S]

Táto rovnica sa nazýva Michaelis-Mentenova rovnica.

Michaelis-Mentenova rovnica je základná rovnica kinetiky enzýmov, ktorá popisuje závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu.

Ak je koncentrácia substrátu výrazne väčšia ako Km (S >> Km), potom zvýšenie koncentrácie substrátu o hodnotu Km nemá prakticky žiadny vplyv na súčet (Km + S) a možno ho považovať za rovný koncentrácii substrátu . V dôsledku toho sa rýchlosť reakcie rovná maximálnej rýchlosti: V = Vmax. Za týchto podmienok má reakcia nultý rád, t.j. nezávisí od koncentrácie substrátu. Môžeme dospieť k záveru, že Vmax je konštantná hodnota pre danú koncentráciu enzýmu, nezávislá od koncentrácie substrátu.

Ak je koncentrácia substrátu výrazne nižšia ako Km(S<< Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Vmax a Km sú kinetické charakteristiky účinnosti enzýmu.

Vmax charakterizuje katalytickú aktivitu enzýmu a má rozmer rýchlosti enzymatickej reakcie mol/l, t.j. určuje maximálnu možnosť tvorby produktu pri danej koncentrácii enzýmu a za podmienok nadbytku substrátu. Km charakterizuje afinitu daného enzýmu k danému substrátu a je to konštantná hodnota, ktorá nezávisí od koncentrácie enzýmu. Čím nižšia Km, tým väčšia je afinita enzýmu k danému substrátu, tým vyššia je počiatočná reakčná rýchlosť a naopak, čím väčšia Km, tým nižšia je počiatočná rýchlosť reakcie, tým nižšia je afinita enzýmu k substrátu.

Toto odvetvie enzymológie študuje vplyv rôznych faktorov na rýchlosť enzymatickej reakcie. Berúc do úvahy všeobecnú rovnicu pre enzymatickú katalýzu reverzibilnej reakcie premeny jedného substrátu na jeden produkt (1),

Hlavné faktory ovplyvňujúce rýchlosť enzymatickej reakcie by mali byť menované: koncentrácia substrátu [S], koncentrácia enzýmu [E] a koncentrácia reakčného produktu [P].

Interakciu niektorých enzýmov s ich substrátom možno opísať hyperbolickou krivkou závislosti rýchlosti enzymatickej reakcie V od koncentrácie substrátu [S] (obr. 19): Obr.

Obr. 19. Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu.

Na tejto krivke možno rozlíšiť tri úseky, ktoré možno vysvetliť ustanoveniami mechanizmu interakcie enzýmu so substrátom: OA - úsek priamo úmernej závislosti V na [S], aktívnych centrách enzýmu. sa postupne plnia molekulami substrátu za vzniku nestabilného komplexu ES; úsek AB - krivočiara závislosť V na [S], ešte nebolo dosiahnuté úplné nasýtenie aktívnych centier enzýmu molekulami substrátu. ES komplex je nestabilný pred dosiahnutím prechodného stavu, pravdepodobnosť reverznej disociácie na E a S je stále vysoká; úsek BC - závislosť je opísaná rovnicou nultého rádu, rez je rovnobežný s osou [S], dosiahlo sa úplné nasýtenie aktívnych enzýmov molekulami substrátu, V=V max.

Charakteristický tvar krivky je matematicky opísaný Briggsovou-Haldaneovou rovnicou:

V=V max ● [S]/Km + [S] (2),

kde Km je Michaelis-Mentenova konštanta, číselne rovná koncentrácii substrátu, pri ktorej sa rýchlosť enzymatickej reakcie rovná polovici V max.

Čím nižšia je Km enzýmu, tým vyššia je afinita enzýmu k substrátu, tým rýchlejšie sa dosiahne prechodný stav pre substrát a ten sa zmení na reakčný produkt. Nájdenie hodnôt Km pre každý enzýmový substrát špecifický pre skupinu je dôležité pri určovaní biologickej úlohy tohto enzýmu v bunke.

Pre väčšinu enzýmov je nemožné zostrojiť hyperbolickú krivku (obr. 19). V tomto prípade sa používa metóda dvojitých reciprokál (Lineweaver-Burk), t.j. vykreslí sa grafická závislosť 1/[V] od 1/[S] (obr. 20). Spôsob konštrukcie takýchto kriviek v experimente je veľmi vhodný pri štúdiu účinku rôznych typov inhibítorov na aktivitu enzýmov (pozri ďalej v texte).

Obr.20. Graf 1/[V] oproti 1/[S] (Lineweaver-Burk metóda),

kde y je medzný úsek - a x je medzný úsek - , dotyčnica uhla α - .

Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie V od koncentrácie enzýmu [E].

Táto grafická závislosť (obr. 21) sa uvažuje pri optimálnej teplote a pH prostredia, pri koncentráciách substrátu výrazne vyšších ako je saturačná koncentrácia aktívnych centier enzýmu.

Ryža. 21. Vplyv koncentrácie enzýmu na rýchlosť enzymatickej reakcie.

Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie kofaktora alebo koenzýmu. Pri komplexných enzýmoch je potrebné vziať do úvahy, že nedostatok koenzýmových foriem vitamínov v prípade hypovitaminózy a narušenie príjmu kovových iónov do tela nevyhnutne vedie k zníženiu koncentrácie zodpovedajúcich enzýmov potrebných na priebeh. metabolických procesov. Preto treba konštatovať, že aktivita enzýmu je priamo závislá od koncentrácie kofaktora alebo koenzýmu.

Vplyv koncentrácie produktu na rýchlosť enzymatickej reakcie. Pri reverzibilných reakciách vyskytujúcich sa v ľudskom tele je potrebné vziať do úvahy, že produkty priamej reakcie môžu byť enzýmom použité ako substráty pre reverznú reakciu. Preto smer prúdenia a okamih dosiahnutia Vmax závisia od pomeru koncentrácií počiatočných substrátov a reakčných produktov. Napríklad aktivita alanínaminotransferázy, ktorá katalyzuje transformáciu:

Alanín + Alfa-ketoglutarát ↔ Pyruvát + Glutamát

závisí v bunke od pomeru koncentrácie:

[alanín + alfa-ketoglutarát] / [pyruvát + glutamát].

MECHANIZMUS PÔSOBENIA ENZÝMU. TEÓRIE KATALYZY ENZÝMOV

Enzýmy, podobne ako neproteínové katalyzátory, zvyšujú rýchlosť chemickej reakcie vďaka svojej schopnosti znižovať aktivačnú energiu tejto reakcie. Aktivačná energia enzymatickej reakcie sa vypočíta ako rozdiel medzi hodnotou energie v systéme prebiehajúcej reakcie, ktorá dosiahla prechodový stav, a energiou určenou na začiatku reakcie (pozri grafickú závislosť na obr. 22).

Ryža. 22. Grafická závislosť energetického stavu chemickej reakcie bez enzýmu (1) a za prítomnosti enzýmu (2) od reakčného času.

Práca V. Henryho a najmä L. Michaelisa, M. Mentena o štúdiu mechanizmu monosubstrátových reverzibilných enzymatických reakcií umožnila predpokladať, že enzým E sa najskôr reverzibilne a pomerne rýchlo spája so svojim substrátom S za vzniku enzýmu- substrátový komplex (ES):

E+S<=>ES (1)

K tvorbe ES dochádza v dôsledku vodíkových väzieb, elektrostatických, hydrofóbnych interakcií, v niektorých prípadoch kovalentných, koordinačných väzieb medzi bočnými radikálmi aminokyselinových zvyškov aktívneho centra a funkčnými skupinami substrátu. V komplexných enzýmoch môže funkciu kontaktu so substrátom vykonávať aj neproteínová časť štruktúry.

Komplex enzým-substrát sa potom rozpadne v druhej, pomalšej, reverzibilnej reakcii za vzniku reakčného produktu P a voľného enzýmu E:

ES<=>EP<=>E + P (2)

V súčasnosti, vďaka práci vyššie uvedených vedcov, ako aj Keilin D., Chance B., Koshland D. (teória „indukovanej korešpondencie“), existujú teoretické ustanovenia o štyroch hlavných bodoch mechanizmu účinku enzýmu na substráte, ktoré určujú schopnosť enzýmov urýchliť chemické reakcie:

1. Orientácia a prístup . Enzým je schopný viazať molekulu substrátu takým spôsobom, že väzba napadnutá enzýmom je nielen umiestnená v tesnej blízkosti katalytickej skupiny, ale je aj voči nej správne orientovaná. Pravdepodobnosť, že komplex ES dosiahne prechodný stav prostredníctvom orientácie a blízkosti, sa výrazne zvyšuje.

2. Stres a záťaž : vyvolaná korešpondencia. Pripojenie substrátu môže spôsobiť konformačné zmeny v molekule enzýmu, ktoré vedú k napätiu v štruktúre aktívneho centra, a tiež trochu deformovať viazaný substrát, čím sa uľahčí dosiahnutie prechodného stavu komplexom ES. Medzi molekulami E a S vzniká takzvaná indukovaná korešpondencia.

Keď sa teplota prostredia zvyšuje, rýchlosť enzymatickej reakcie sa zvyšuje, dosahuje maximum pri nejakej optimálnej teplote a potom klesá na nulu. Pre chemické reakcie platí pravidlo, že pri zvýšení teploty o 10°C sa rýchlosť reakcie zvýši dvakrát až trikrát. Pre enzymatické reakcie je tento teplotný koeficient nižší: na každých 10 °C sa rýchlosť reakcie zvýši 2-krát alebo ešte menej. Následné zníženie reakčnej rýchlosti na nulu indikuje denaturáciu enzýmového bloku. Optimálne teplotné hodnoty pre väčšinu enzýmov sú v rozmedzí 20 - 40 0 ​​C Termolabilita enzýmov je spojená s ich proteínovou štruktúrou. Niektoré enzýmy sú denaturované už pri teplote okolo 40 0 C, ale ich hlavná časť sa inaktivuje pri teplotách nad 40 - 50 0 C. Niektoré enzýmy sú inaktivované chladom, t.j. pri teplotách blízkych 0°C dochádza k denaturácii.

Zvýšenie telesnej teploty (horúčka) urýchľuje biochemické reakcie katalyzované enzýmami. Je ľahké vypočítať, že každý stupeň zvýšenia telesnej teploty zvyšuje rýchlosť reakcie asi o 20%. Pri vysokých teplotách okolo 39-40°C treba nehospodárne využitie endogénnych substrátov v bunkách chorého organizmu doplniť potravou. Navyše pri teplote okolo 40°C môže dôjsť k denaturácii niektorých veľmi termolabilných enzýmov, čo narúša prirodzený priebeh biochemických procesov.

Nízka teplota spôsobuje reverzibilnú inaktiváciu enzýmov v dôsledku miernej zmeny v jeho priestorovej štruktúre, ktorá však postačuje na narušenie vhodnej konfigurácie aktívneho centra a molekúl substrátu.

Závislosť rýchlosti reakcie od pH média

Väčšina enzýmov má špecifickú hodnotu pH, pri ktorej je ich aktivita najväčšia; Nad a pod touto hodnotou pH aktivita týchto enzýmov klesá. Avšak nie vo všetkých prípadoch majú krivky opisujúce závislosť aktivity enzýmu od pH zvonovitý tvar; niekedy môže byť táto závislosť vyjadrená aj priamo. Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od pH indikuje najmä stav funkčných skupín aktívneho centra enzýmu. Zmena pH média ovplyvňuje ionizáciu kyslých a zásaditých skupín aminokyselinových zvyškov aktívneho centra, ktoré sa podieľajú buď na väzbe substrátu (v kontaktnom mieste), alebo na jeho premene (v katalytickom mieste). ). Špecifický účinok pH teda môže byť spôsobený buď zmenou afinity substrátu k enzýmu, alebo zmenou katalytickej aktivity enzýmu, alebo oboma dôvodmi súčasne.

Väčšina substrátov má kyslé alebo zásadité skupiny, takže pH ovplyvňuje stupeň ionizácie substrátu. Enzým sa prednostne viaže buď na ionizovanú alebo neionizovanú formu substrátu. Je zrejmé, že pri optimálnom pH sú funkčné skupiny aktívneho miesta v najreaktívnejšom stave a substrát je vo forme preferovanej pre väzbu týmito enzýmovými skupinami.

Pri konštrukcii kriviek opisujúcich závislosť aktivity enzýmu od pH sa merania pri všetkých hodnotách pH zvyčajne vykonávajú za podmienok nasýtenia enzýmu substrátom, pretože hodnota Km sa pre mnohé enzýmy mení so zmenami pH.

Krivka charakterizujúca závislosť aktivity enzýmu od pH môže mať obzvlášť jednoduchý tvar v prípadoch, keď enzým pôsobí na elektrostaticky neutrálne substráty alebo substráty, v ktorých nabité skupiny nehrajú významnú úlohu v katalytickom pôsobení. Príkladom takýchto enzýmov je papaín, ako aj invertáza, ktorá katalyzuje hydrolýzu neutrálnych molekúl sacharózy a udržiava konštantnú aktivitu v rozmedzí pH 3,0-7,5.

Hodnota pH zodpovedajúca maximálnej aktivite enzýmu sa nemusí nevyhnutne zhodovať s hodnotou pH charakteristickou pre normálne vnútrobunkové prostredie tohto enzýmu; posledné uvedené môže byť buď nad alebo pod optimom pH. To naznačuje, že vplyv pH na aktivitu enzýmu môže byť jedným z faktorov zodpovedných za reguláciu enzymatickej aktivity v bunke. Keďže bunka obsahuje stovky enzýmov a každý z nich reaguje na zmeny pH inak, hodnota pH v bunke je možno jedným z dôležitých prvkov v komplexnom systéme regulácie bunkového metabolizmu.